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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 9445 (2023) Citar este artículo

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Las pseudomonas son metabólicamente flexibles y pueden prosperar en diferentes plantas hospedantes. Sin embargo, se desconocen las adaptaciones metabólicas necesarias para la promiscuidad del huésped. Aquí, abordamos esta brecha de conocimiento empleando RNAseq y comparando las respuestas transcriptómicas de Pseudomonas donghuensis P482 con los exudados de raíces de dos plantas hospedantes: tomate y maíz. Nuestro objetivo principal fue identificar las diferencias y los puntos comunes entre estas dos respuestas. Las vías reguladas positivamente sólo por los exudados de tomate incluyeron la desintoxicación del óxido nítrico, la reparación de grupos de hierro y azufre, la respiración a través del citocromo bd, insensible al cianuro, y el catabolismo de aminoácidos y/o ácidos grasos. Los dos primeros indican la presencia de donantes de NO en los exudados de las plantas de prueba. El maíz indujo específicamente la actividad de la bomba de eflujo tipo MexE RND y la tolerancia al cobre. Los genes asociados con la motilidad fueron inducidos por el maíz pero reprimidos por el tomate. La respuesta compartida a los exudados parecía verse afectada tanto por compuestos originados en las plantas como por los de su entorno de crecimiento: la resistencia al arsénico y la síntesis de bacterioferritina estaban reguladas positivamente, mientras que la asimilación de azufre, la detección de citrato férrico y/u otros transportadores de hierro, la adquisición de hemo y El transporte de aminoácidos polares estaba regulado negativamente. Nuestros resultados proporcionan direcciones para explorar los mecanismos de adaptación del huésped en microorganismos asociados a plantas.

Las plantas nutren las comunidades microbianas de la rizosfera liberando mezclas de compuestos orgánicos a través de las raíces1. Los exudados radiculares contienen metabolitos primarios como ácidos orgánicos, aminoácidos, azúcares y metabolitos secundarios con propiedades bioactivas o de señalización. La composición química exacta de los exudados depende de la especie de planta y del estado fisiológico de la planta; este último depende de la etapa de desarrollo, la disponibilidad de nutrientes y la presencia de factores estresantes2. Las diferencias en la composición de los exudados y el funcionamiento de la inmunidad innata de la planta determinan la composición y la actividad de la microbiota radicular3.

La bacteria Pseudomonas puede prosperar en varios nichos ambientales, incluidas las raíces de varias plantas hospedantes. Su ventaja competitiva implica flexibilidad metabólica y la producción de una amplia gama de metabolitos secundarios, incluidos antimicrobianos y compuestos eliminadores de hierro4. Muchas cepas asociadas a plantas facilitan el crecimiento de las plantas, alivian el estrés abiótico o las protegen contra patógenos5. No existen estudios exhaustivos sobre la amplitud filogenética de las plantas que una determinada cepa de Pseudomonas puede colonizar. Sin embargo, ciertas pseudomonas han demostrado ser efectivas como agentes de biocontrol en especies de plantas diferentes a las de su origen o en cultivos múltiples, lo que sugiere que las pseudomonas son colonizadores de plantas bastante promiscuos6.

Existe un reconocimiento creciente de que las especies de plantas seleccionan comunidades microbianas distintivas7, y las plantas hospedantes filogenéticamente más distantes reclutan las poblaciones de microbiota más distintas8. Por lo tanto, la aparente promiscuidad del huésped de algunos microorganismos, como las pseudomonas, plantea interrogantes sobre los cambios metabólicos necesarios de las bacterias para colonizar múltiples huéspedes o para mantener una asociación con un huésped que sufre cambios fisiológicos. Este problema ha sido difícil de abordar con los datos existentes, ya que la mayoría de los estudios abordan únicamente las interacciones entre el huésped y el microbio. Además, si bien los determinantes de la especificidad del huésped en las interacciones planta-microbio se han estudiado en profundidad para los rizobios simbióticos, han recibido poca atención en las bacterias que forman asociaciones menos íntimas con sus huéspedes9.

Pseudomonas donghuensis P482 es una cepa de biocontrol que inhibe el crecimiento de varios patógenos vegetales bacterianos y fúngicos10,11. Originalmente aislada de la rizosfera del tomate (Solanum lycopersicum L.), la bacteria también puede colonizar la rizosfera de la papa12 y, como se muestra en este estudio, las raíces del maíz, lo que la convierte en un modelo prometedor para estudiar los rasgos adaptativos del huésped en especies promiscuas. Bacterias colonizadoras de raíces.

En este trabajo, investigamos qué rutas metabólicas pueden ser parte de una respuesta adaptativa de pseudomonas a diferentes plantas hospedantes mediante la identificación de genes de respuestas transcriptómicas diferenciadoras ("específicas del huésped") y compartidas ("independientes del huésped") de Pseudomonas donghuensis. P482 a exudados de raíces de dos especies de plantas filogenéticamente distintas: tomate (dicotiledónea) y maíz (monocotiledónea).

Los métodos de este estudio están de acuerdo con las directrices y la legislación institucionales, nacionales e internacionales pertinentes. Los protocolos de este estudio también cumplen con la Declaración de Política de la UICN sobre Investigación de Especies en Riesgo de Extinción y la Convención sobre el Comercio de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres.

El ensayo de colonización de la rizosfera se realizó utilizando P482 Rif, un mutante espontáneo de P48212 resistente a la rifampicina. Las plantas se cultivaron durante 18 días en suelo no estéril a partir de semillas inoculadas con P482. Los detalles experimentales se pueden encontrar en Información complementaria (SI).

Tomate (Solanum lycopersicum L.) cv. Saint Pierre (Vilmorin Garden, Polonia) y maíz (Zea mays L.) cv. Bejm (proporcionado por el Instituto de Aclimatación y Mejoramiento Vegetal, Smolice, Polonia) se cultivaron a partir de semillas.

Las semillas de tomate se esterilizaron tratándolas con etanol al 70% durante 1 minuto, seguido de 3 minutos en NaOCl al 3% y enjuagando 3 veces con agua destilada estéril. La superficie de las semillas de maíz se esterilizó tratándolas dos veces con NaOCl al 3% durante 15 minutos, seguido de 10 minutos en etanol al 70% y enjuagando 3 veces con agua destilada estéril. Las semillas esterilizadas en superficie se germinaron en medio de germinación (GM) (0,5 × medio Murashige y Skoog con vitaminas Gamborg B5, 2% de sacarosa, 0,2% de peptona de trigo y 0,7% de agar vegetal, pH ≈ 6,1). La ventaja de utilizar transgénicos es que, gracias a la adición de peptona, permite detectar la contaminación microbiana de las semillas en germinación. El tomate germinó en oscuridad a 24 °C, mientras que el maíz germinó en luz a 22 °C. Las semillas germinadas sin signos de infección se transfirieron a recipientes con un cuarto de galón de arena de grano grande (1,4 a 2 mm) (AQUAEL, Polonia). Las condiciones de cultivo se optimizaron para el tamaño y los requisitos nutricionales de cada especie: el maíz se cultivó en frascos de vidrio de 900 ml en ¼ de medio de Hoagland, pH 5,6–5,8 (mezcla de sal basal Hoagland No. 2, Merck), 3 plántulas por frasco, mientras que el tomate se cultivó en recipientes GA-7 Magenta (Merck), 6 plantas por recipiente, en medio ½ Hoagland. Las plantas se cultivaron durante 13 días a 22 °C, fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Ambas especies de plantas desarrollaron un segundo par de hojas durante este período.

Se retiraron de la arena las plantas cultivadas en condiciones gnotobióticas. Las raíces se lavaron en agua durante 2 a 4 minutos, se transfirieron a vasos de vidrio que contenían agua esterilizada de alta pureza y se incubaron durante 2 h. Algunas hojas de las pequeñas tomateras tocaron la superficie del agua. Se recolectaron exudados de 174 plantas de tomate y 48 plantas de maíz para obtener suficientes exudados para cultivos bacterianos (RNAseq) y análisis químicos. Este número de plantas produjo 4,5 mg de exudados de tomate y 6,6 mg de exudados de maíz. Las muestras de cada especie se agruparon y se esterilizaron por filtración a través de una membrana de PES de baja unión de 0,22 µm (Thermo Scientific). Las muestras se congelaron a -80 °C y se liofilizaron.

El análisis no dirigido de la composición química de los exudados radiculares se realizó mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y resonancia magnética nuclear (RMN). La cantidad relativa de 21 aminoácidos se evaluó con espectrometría de masas de seguimiento de reacción seleccionada por cromatografía líquida (LC-SRM). Todos los detalles se proporcionan en Información complementaria (SI).

P482 se cultivó a 28 °C en medio 1C (sales M9, Mg2SO4 2 mM, CaCl2 0,1 mM, glucosa al 0,4%13), con o sin (control) exudados liofilizados de tomate o maíz. El experimento se realizó en placas de 96 pocillos, se incubaron con agitación orbital en un lector de microplacas EPOCH (BioTek), y se midió la DO600 cada 20 min. Se probaron tres concentraciones de exudados (0,02 mg L-1, 0,1 mg L-1, 0,2 mg L-1) para verificar su impacto en los parámetros de crecimiento de P482 (Fig. S1). Posteriormente se aplicó la concentración más alta para cultivar células para interrogarlas con RNAseq, ya que se consideró que la concentración más alta tenía más probabilidades de provocar cambios en la expresión genética inducidos por el exudado. El pH del medio se midió antes de la inoculación y después del crecimiento de P482 hasta una fase estacionaria temprana utilizando tiras indicadoras de pH MQuant (Supelco).

Las bacterias se recolectaron al alcanzar la fase estacionaria temprana, después de 33 h de crecimiento en medio 1C sin suplementar y 24 y 28 h, respectivamente, para el crecimiento en medio 1C con exudados de maíz o tomate (OD600 0,35–0,48) (Fig. S1). Por cada tratamiento, se recogieron tres grupos de células (aprox. 109) mediante centrifugación y se fijaron con fixRNA (Eurx, Polonia). Cada conjunto se trató como una réplica biológica separada en la RNAseq posterior. El ARN total se aisló utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen). El ARN purificado se trató con el kit TURBO DNA-free™ (Thermo Fisher Scientific). La falta de contaminación por ADNg se confirmó mediante PCR en tiempo real con cebadores dirigidos a gyrB.

Se secuenciaron nueve muestras de ARN, con 3 réplicas biológicas por cada uno de los dos tratamientos de exudado y el control (1 medio C solo). La evaluación de la integridad del ARN, el agotamiento del ARNr, la preparación de la biblioteca, la secuenciación de Illumina (mínimo 5 GB por muestra), el ensamblaje del transcriptoma y el análisis diferencial de la expresión génica se subcontrataron a Baseclear (Leiden, Países Bajos). Las lecturas de RNA-seq filtradas se asignaron al genoma de referencia de P482 (Genbank: JHTS00000000.1) 14. Las estadísticas posteriores al filtrado y la alineación están disponibles en las Tablas S1 y S2, respectivamente. Se aplicó el análisis de componentes principales para verificar si las muestras replicadas forman grupos separados (Fig. S2). El análisis de expresión génica diferencial se realizó utilizando DESeq2 1.22.215. Se realizaron más análisis internamente. Los cambios en la expresión génica se filtraron para determinar su significancia biológica (cambio de 1,5 log2 veces (FC)) y estadística (p <0,05; valor de p ajustado, corrección de Benjamini-Hochberg (B-H) para controlar la tasa de descubrimiento falso (FDR)). Los genes con padj> 0,05 y aquellos a los que no se les pudo asignar el valor ajustado (NA) se excluyeron del análisis posterior. Se visualizaron grupos superpuestos de genes expresados ​​diferencialmente con BioVenn16. Las proteínas se asignaron a grupos de grupos ortólogos (COG) utilizando eggNOG mapper 5.017 y a rutas metabólicas KEGG utilizando BlastKOALA18,19,20,21. El enriquecimiento dentro de las vías COG y KEGG se estableció utilizando el genoma de P482 como referencia (JHTS00000000.1), y se aplicó la prueba exacta de Fisher para determinar la significación estadística (p <0,05; valor de p ajustado, corrección B-H). Las redes de genes y el enriquecimiento de grupos se analizaron utilizando STRING 11.5 (mayo de 2023)22, con el genoma de P. donghuensis HYS como referencia11.

Los datos de RNAseq se validaron mediante RT-qPCR utilizando seis objetivos con diferentes patrones de expresión: BV82_3254, mexE, norC, ssuC, trpB e ytfE. La transcripción inversa y la qPCR en tiempo real se realizaron como se describió anteriormente23. Los detalles del cebador están disponibles en la Tabla S3. El tamaño de los amplicones se confirmó mediante electroforesis en gel (Fig. S3). El análisis de expresión génica se realizó utilizando qbase + 24. Los genes de referencia aplicados, gyrB y rpoD, se eligieron en función de nuestro trabajo anterior23 y se confirmó su estabilidad en el conjunto de datos analizado (promedio M = 0,543; CV = 0,181). La expresión se amplió a las muestras procedentes de P482 cultivadas en medio 1C sin exudados (sin tratar). La significación estadística de las diferencias en la expresión se evaluó mediante una prueba t no apareada.

P482 Rif estaba presente en las raíces de plantas de tomate y maíz de 18 días cultivadas en el suelo a partir de semillas inoculadas. Según medias aritméticas, el tamaño de la población en las raíces del tomate fue aproximadamente diez veces mayor que el de las raíces del maíz, ascendiendo a 1,54 × 107 UFC g-1 en el tomate y 2,35 × 106 UFC g-1 en el maíz (Fig. S4). Cuando se consideraron los valores medianos, la diferencia fue 25 veces mayor, con tamaños de población de 8,1 × 106 UFC g-1 y 3,1 × 105 UFC g-1 para tomate y maíz, respectivamente. A pesar de la diferencia, el tamaño de la población de P482 en ambas plantas puede considerarse alto, lo que implica que la cepa puede adaptarse para colonizar a ambos huéspedes.

Se realizó un perfil del transcriptoma completo para células P482 cultivadas en presencia de exudados de raíces de tomate o maíz (0,2 mg L-1), los cuales estimularon el crecimiento de la bacteria en comparación con el medio 1C solo (Fig. S1A, B). Se detectaron 5.168 genes en el transcriptoma, que cubren el 99% de todo el genoma. La confiabilidad de medir la abundancia de transcripciones mediante RNAseq se confirmó mediante qPCR en tiempo real con transcripción inversa (RT-qPCR) para objetivos seleccionados (Fig. S5).

Los exudados de tomate alteraron la expresión de 413 genes (7,99%) en comparación con el medio no suplementado. Estos se conocen además como genes expresados ​​diferencialmente inducidos por tomate (tiDEG). Los exudados de maíz influyeron en la expresión de 181 genes (3,51%), también denominados miDEG (DEG inducidos por maíz) (Fig. 1). El hecho de que hubiera más tiDEG que miDEGS y que tuvieran un valor medio de log2FC más alto (2,27 log2FC frente a 2,14 log2FC; conjunto de datos S1), sugiere que la respuesta de P482 a los exudados de tomate fue más amplia y más pronunciada que la de P482 a los exudados de tomate. los exudados del maíz. Queda abierta la cuestión de si esto está relacionado con el hecho de que el maíz no es el huésped original de P482. Se informó una escala similar de respuesta transcriptómica a la de P482 y el tomate para P. aeruginosa PAO1 cultivada en medio CAA suplementado con exudados de remolacha (Beta vulgaris)25. En el último estudio, destinado a identificar genes nuevos y presumiblemente específicos del huésped involucrados en las interacciones planta-microbio, los autores compararon la respuesta de PAO1 a los exudados de dos variedades de remolacha, Celt y Roberta, conocidas por seleccionar diferentes comunidades microbianas. Dependiendo de la variedad, el 9,30% y el 8,13% del transcriptoma de PAO1 se vieron afectados por exudados.

Diagrama de Venn que representa los subconjuntos de genes en los transcriptomas activados por tomate y maíz de P. donghuensis P482 (A), y la proporción de genes regulados hacia arriba y hacia abajo en cada subconjunto (B). tiDEG (413) y miDEG (181) mostraron una expresión significativamente diferente en respuesta a los exudados de raíces de tomate o maíz, respectivamente, en comparación con el medio no suplementado (control). Por el contrario, los genes de la respuesta diferenciadora (GDR, 278), un conjunto rodeado por una línea de puntos, mostraron un cambio significativo en la expresión entre los dos tratamientos de exudado. Los genes de respuesta compartidos (SRG, 63) se establecieron mediante superposición de miDEG, tiDEG y GDR, y comprenden genes afectados por ambos tipos de exudados de manera similar. Subconjuntos adicionales resultantes de la superposición son las RDA específicas del tomate (150) y las RDA específicas del maíz (34). Estos cumplían simultáneamente dos criterios: estaban entre las RDA y al mismo tiempo su expresión era significativamente diferente que en el medio cuando se trataba con un solo tipo de exudado. Límites de significancia para un cambio significativo en la expresión: p <0,05 (padj; corrección B-H); log2FC > 1,5. Se puede encontrar una lista de loci en cada subconjunto en el conjunto de datos S6. En el panel B, los genes regulados positivamente se muestran en magenta (a la izquierda) y los genes regulados negativamente, en azul (a la derecha). Tanto el porcentaje de genes como el recuento de ORF real se indican en los gráficos.

Nuestro objetivo en este estudio fue identificar vías metabólicas que están: (1) reguladas diferencialmente y (2) de manera similar en P482 en respuesta a los exudados de tomate y maíz. Para ello, determinamos dos grupos de genes dentro del transcriptoma: genes de la respuesta diferenciadora (GDR) y genes de respuesta compartida (SRG). Los GDR (278 genes) son genes con expresión significativamente diferente entre los dos tratamientos de exudado (Fig. 1; Conjunto de datos S2). Por el contrario, los SGR (63 genes) muestran respuestas similares a los exudados independientemente de la planta fuente. La superposición de GDR, tiDEG y miDEG determinó el conjunto de SGR. Este análisis además permitió distinguir subconjuntos de RDA que denominamos RDA específicas de tomate (150 genes) y RDA específicas de maíz (34 genes) (Fig. 1; Conjunto de datos S2). Los genes en los subconjuntos de RDA específicos de plantas cumplieron concomitantemente dos criterios: mostraron una expresión diferente en los dos tratamientos de exudado (> 1,5 log2FC, padj < 0,05), lo que los convirtió en RDA, pero también su expresión fue significativamente diferente (> 1,5 log2FC, padj < 0,05) en comparación con el medio 1C tras el tratamiento con solo uno de los exudados. Las GDR específicas del tomate y del maíz, junto con las SGR, se analizaron en busca de genes regulados hacia arriba y hacia abajo de alto rango (Tablas S4 a S6). El establecimiento de GDR específicos de cada planta nos ayudó a asignar ciertos aspectos de la respuesta diferenciadora general a una de las plantas. También evitó que se subestimaran los aspectos de la respuesta diferenciadora impulsados ​​por el maíz, teniendo en cuenta que los exudados de tomate, con una proporción más significativa de las RDA, son el impulsor dominante de los cambios generales.

Se analizó el conjunto completo de 278 GDR (respuesta diferenciadora) y 63 SGR (respuesta compartida) para determinar el enriquecimiento de KEGG y COG y la creación de redes de genes (Figs. 2, 3; Conjuntos de datos S3-S4). Los hallazgos más interesantes se presentan y analizan a continuación, mientras que en SI se describen algunas vías menores.

Las vías KEGG y las categorías COG se enriquecieron significativamente dentro de las respuestas transcriptómicas compartidas (A, B) y diferenciadoras (C, D) de P482 a los exudados de raíces de tomate y maíz. Para genes individuales dentro de las vías: el rojo y el azul indican una regulación positiva y negativa de la expresión génica, respectivamente; la columna de la izquierda muestra los cambios en la expresión (log2FC) al agregar exudados de tomate (letra T), y la columna de la derecha al agregar exudados de maíz (letra M). Categorías de KEGG: a—metabolismo de carbohidratos, b—procesamiento de información ambiental, c—metabolismo de aminoácidos. Los genes que se muestran en negrita se enumeran dentro de las vías y COG de KEGG enriquecidos. Los genes subrayados se superponen entre categorías dentro de las vías KEGG.

Red de genes para los 63 genes de los genes compartidos (A) y 278 de la respuesta transcriptómica diferenciadora (B) de P482 a los exudados de raíces de plantas. El análisis se realizó utilizando STRING con el genoma de P. donghuensis HYS como referencia y la imagen se seleccionó manualmente. Cada nodo representa un gen de P482 con un nombre asignado con eggNOG. Los nodos completados marcan genes que pertenecen a grupos enriquecidos identificados por STRING (mapa: vía KEGG, CL: grupo, GO: ontología de genes, PF, IPR: dominios de proteínas). Los bordes de la red indican confianza. Interacción basada en todas las fuentes disponibles para la versión 11.5 (mayo de 2023). Puntuación mínima de interacción 0,4 (media). Los nodos desconectados fueron desactivados, a excepción de los genes que formaban parte de grupos enriquecidos. Cada gen se puede asociar con una designación de locus utilizando el conjunto de datos S5. La lista completa de interacciones STRING y los grupos enriquecidos se proporciona en el conjunto de datos S4.

Las RDA representaron el 5,38% del transcriptoma, con una proporción aproximadamente igual de reguladas a la baja y al alza. En comparación, los SGR representaron el 1,22% del transcriptoma, la mayoría de ellos regulados negativamente (76%) (Fig. 1). Por lo tanto, el conjunto de genes afectados de manera diferente por dos huéspedes en P482 fue de aprox. 4,5 veces mayor que el conjunto de genes de la respuesta compartida. Lo mismo se observó para PAO1 en dos variedades de remolacha25. En el caso de distintas plantas hospedantes, como el tomate y el maíz, es tentador atribuir este efecto a las diferencias generales relacionadas con las especies en la composición de los exudados. Sin embargo, el hecho de que se haya observado una tendencia similar para dos variedades de una sola especie vegetal, la remolacha, sugiere que cambios relativamente menores en la composición de los compuestos derivados de las plantas pueden tener un impacto revolucionario. De acuerdo con esta suposición, se ha demostrado que compuestos como los benzoxazinoides y las cumarinas ejercen por sí solos un efecto profundo en la composición de la microbiota asociada a las raíces26,27.

Ambos tratamientos con exudado provocaron la regulación negativa de los genes P482 dentro de las vías superpuestas para el "metabolismo del azufre" y los "transportadores ABC" (Fig. 2a, Tabla 1). Esto incluía genes que codifican los componentes CysW y CysA de la permeasa sulfato-tiosulfato (SulT). El sulfato y el tiosulfato representan fuentes inorgánicas de azufre utilizadas por las bacterias28. En ausencia de sulfato inorgánico o cisteína, las bacterias pueden utilizar alcanosulfonatos, incluida la taurina, como fuentes alternativas de azufre28. En P482, ambos exudados regularon negativamente la expresión de tauBC y ssuBC, involucrados en la importación de taurina y otros alcanosulfonatos. Una influencia similar se observó para ssuD y tauD, implicados en la liberación de azufre de esos compuestos29. Además, STRING permitió la identificación de otro gen regulado negativamente posiblemente involucrado en la adquisición de azufre en P482, el sfnR (Fig. 3a). En Pseudomonas putida DS1, se encontró que sfnR era necesario para obtener azufre a partir de sulfuro de dimetilo (DMS)30.

Los resultados muestran que ambos tipos de exudados disminuyen la expresión de múltiples genes relacionados con la adquisición de azufre. También se observó una regulación negativa de los genes ssu, o de los genes ssu y tau, en 6 de 8 Pseudomonas spp. cepas expuestas a los exudados radiculares del pasto Brachypodium distachyon31. Se cultivaron plantas de maíz y tomate para los experimentos con P482 y B. distachyon para los experimentos con otras pseudomonas en medio de Hoagland que contenía sulfatos (MgSO4, ZnSO4, CuSO4). Esto podría influir potencialmente en la disponibilidad de azufre en los exudados de las raíces de las plantas cocultivadas. Por otro lado, en ambos estudios se detectó cisteína y metionina en los exudados, que pueden ser una fuente de azufre orgánico para la bacteria Pseudomonas.

La respuesta común de P482 a los exudados incluyó la regulación positiva de arsC y arsH (Tabla 1). Ambos genes están relacionados con el metabolismo del arsénico, un metaloide altamente tóxico. El arsénico está omnipresente en el medio ambiente, incluido el suelo; por tanto, las bacterias han desarrollado diferentes mecanismos para procesarlo32. ArsC es una arsenato reductasa que transforma el arseniato pentavalente (As(V)) en arsenito trivalente (As(III)) antes de la salida de As(III) de la célula33. El segundo gen regulado positivamente en P482, arsH, confiere resistencia a ciertos microorganismos a los organoarsenicales como las formas trivalentes del herbicida metilarsenato monosódico y el aromático fenilarsenito arsénico33.

Se considera que la mayoría de las especies de arsénico metilado presentes en el medio ambiente son de origen microbiano. Se informó que algunos microorganismos utilizan arsenicales metilados como armas contra sus competidores microbianos34. Las plantas, a diferencia de los microbios, no metilan el arsénico35. En cambio, absorben arsénicos inorgánicos del suelo en forma de arseniato, probablemente a través de transportadores de fosfato debido a la similitud de esas moléculas, y los extruyen de regreso al suelo a través de las raíces una vez que se reducen a arsenito trivalente36. Nuestra hipótesis es que la expresión aumentada de arsC y arsH en P482 podría haber sido provocada por arseniato y organoarsnicales transferidos a las raíces desde el sustrato arenoso utilizado para el crecimiento de tomate y maíz.

Una de las categorías del COG enriquecidas dentro de la respuesta compartida fue "Transporte y metabolismo de iones inorgánicos/Mecanismo de transducción de señales". Esta categoría de doble función estuvo representada por siete genes similares a fecR (Tabla 1). Las proteínas FecR son sensores transmembrana implicados en la transducción de señales. En Escherichia coli, FecR coopera con el factor sigma FecI y la proteína receptora FecA para dirigir la expresión del operón fecABCDE implicado en la captación de citrato férrico37. Sin embargo, las especies bacterianas pueden albergar muchos genes similares a fecR. En el genoma de P. aeruginosa, hay catorce genes similares a fecR ubicados adyacentes a factores sigma de falta de hierro que potencialmente pueden inducirse en presencia de diferentes portadores de hierro afines38. Además de utilizar sideróforos de fabricación propia, las pseudomonas pueden utilizar los producidos por otras bacterias o plantas, trasladando el coste energético de su producción a otros organismos39, un fenómeno denominado "piratería de sideróforos"40.

Otras fuentes de hierro que pueden utilizar las pseudomonas son las moléculas de hemo liberadas por las hemoproteínas41. Entre los SGR de P482, el gen que muestra la regulación negativa más significativa codifica una proteína de la familia A de unión al hemo (- 6,8 log2FC) (Tabla S6). Otros genes implicados en la absorción y el metabolismo del hemo también estaban regulados negativamente. Estos incluyeron: hasR, hemO, hmuU y hmuV, y hasD (Tabla 1).

Para abordar con más detalle cómo la adición de exudados de raíz influyó en la disponibilidad de hierro para P482 en nuestros experimentos, hemos investigado los niveles de expresión de 3 genes: BV82_1009, una sintasa de tipo NRPS involucrada en la síntesis del potente sideróforo pioverdina; BV82_1008, (pvdS), un factor sigma implicado en la regulación de la síntesis de pioverdina, y BV82_4709 implicado en la síntesis de 7-hidroxitropolona, ​​un compuesto con propiedades antimicrobianas y de eliminación de hierro más características de P. donghuensis11. Los exudados de raíces afectaron la expresión de ninguno de estos genes (conjunto de datos S5). La expresión de pioverdina tampoco aumentó en ninguna de las ocho cepas de Pseudomonas cultivadas en exudados de raíces de B. distachyon31. En el último estudio, la regulación positiva de otros genes relacionados con la adquisición de hierro se observó sólo en la mitad de estas cepas. Estos incluyeron: transportadores de dicitrato de hierro (cepas SBW25 y 30–84), biosíntesis de sideróforos ornicorrugatina (SBW25) y pioquelina (cepa Pf-5), enzimas que degradan el hemo (2–79, 30–84) y genes asociados a TonB. (2–79 y Pf-5). En otro estudio, la expresión de genes relacionados con la adquisición de hemo y la síntesis de pioverdina en P. protegens CHA0 fue relativamente baja en respuesta al trigo en comparación con la observada durante la infección de insectos42.

En contraste con la regulación negativa de los genes para la adquisición de hierro, los exudados de las raíces tanto del tomate como del maíz aumentaron significativamente la expresión del gen de la bacterioferritina bfr implicado en la homeostasis del hierro intracelular. Bfr actúa en el almacenamiento de hierro que, cuando está presente en exceso en forma libre, puede provocar estrés oxidativo en las células mediante la generación de especies reactivas de oxígeno43. Se demostró que la bacterioferritina y las proteínas que interactúan con Bfr son esenciales para la resistencia al estrés y la virulencia en patógenos tanto vegetales como animales44,45. También desempeñan un papel en los simbiontes de plantas noduladoras de raíces46.

La regulación positiva de Bfr en P482 es otra premisa indirecta de que los exudados de raíz por sí solos no son limitantes de hierro para P482 y al menos para algunas otras pseudomonas. Sin embargo, es muy probable que P482 necesite emplear sus mecanismos de eliminación de hierro en presencia de competidores microbianos.

Tras la exposición de P482 a ambos exudados, observamos una mayor expresión de tagQ, pppA y crp. En P. aeruginosa, tagQ y pppA participan en la cascada reguladora que controla la activación del sistema de secreción tipo VI (T6SS), considerándose pppA un regulador negativo de T6SS47. El tercer gen, crp, codifica una proteína similar al receptor de AMP cíclico. Los informes sobre el papel de la Crp en la regulación del T6SS son escasos y se refieren a Vibrio cholerae, donde se sugirió que la Crp era un regulador positivo del T6SS48. En general, nuestros resultados sugieren que la presencia de exudados de raíces tiene algún impacto en T6SS en P482 cultivado en monocultivos. Sin embargo, la dirección de este impacto requiere más estudios. También podemos suponer que la expresión de genes relacionados con T6SS sería diferente en presencia de (micro)organismos competidores. El T6SS permite a las bacterias inyectar proteínas en otras células procarióticas o eucariotas y es mejor conocido por su papel en la competencia interbacteriana49.

El P482 tratado con tomate mostró síntomas de estrés causado por el óxido nítrico (también conocido como estrés nitrosativo). El óxido nítrico es una molécula de libre difusión que ejerce efectos tóxicos sobre las células. Para contrarrestar el estrés nitrosativo, las bacterias han desarrollado varias vías para convertir el NO en moléculas no dañinas como N2O, NO3- o amoníaco50. Uno de los dos genes con la regulación positiva más sustancial en P482 fue el hmp (BV82_4743), que codifica la flavohemoglobina (Hmp). La expresión de este gen aumentó mucho (6,13 log2FC) en P482 cultivado en exudados de tomate pero no en maíz. En condiciones aeróbicas, Hmp cataliza la reacción de NO con oxígeno para producir nitrato (NO3-)51. Se observó un patrón similar de cambios en la expresión genética en norD, norC y norB que codifican la óxido nítrico reductasa (NOR). Esta enzima integrada en la membrana cataliza la reducción del óxido nítrico (NO) a óxido nitroso (N2O)52. Hmp y NOR son componentes bien documentados del mecanismo desintoxicante de NO en las bacterias.

El NO que actúa sobre una célula bacteriana puede originarse en el medio ambiente o ser generado por las propias células. El NO es un intermediario conocido en la reducción gradual de nitrato, a través de nitrito, a óxido de nitrógeno53. Este proceso, llamado desnitrificación, puede ser realizado por algunas bacterias Pseudomonas bajo disponibilidad limitada de oxígeno para superar la escasez de oxígeno como aceptor terminal de electrones en la respiración54. La formación de NO a partir de nitrito en el segundo paso de la desnitrificación requiere la actividad de NirS, una nitrito reductasa del citocromo cd1 periplásmico que transporta cofactores hemo cy hemo d155. P. donghuensis P482 posee un homólogo de nirS (BV82_3250) y homólogos de muchos otros genes del grupo nir (nirCFLGHNBDJM). En P482 tratado con exudados de tomate, la regulación positiva de los genes desintoxicantes de NO no estuvo acompañada por la inducción de genes nir. Por lo tanto, la causa subyacente de la activación de las vías de desintoxicación de NO en P482 no es un cambio de desnitrificación sino más bien hacer frente a la toxicidad del NO exógeno presente en los exudados de tomate.

Los efectos nocivos del NO resultan predominantemente de la inactivación de proteínas que contienen grupos hierro-azufre (Fe-S)56,57. Los grupos Fe-S son cofactores proteicos activos redox presentes en casi todos los organismos y necesarios para muchos procesos bioquímicos fundamentales58. En P482 tratado con tomate, vimos una importante regulación positiva de yftE (6,36 log2FC), conocida por su papel en el metabolismo/reparación de grupos de Fe-S. Los homólogos de ytfE están presentes en numerosas bacterias59, y el gen se regula constantemente al alza tras la exposición bacteriana al NO60. Se demostró que la proteína YftE contribuye a la supervivencia de Yersinia pseudotuberculosis en el bazo después del estrés nitrosativo y contribuye a la virulencia de este patógeno humano57. Otro gen cuya expresión fue inducida significativamente por los exudados de tomate es el nnrS (BV82_3241). NnrS es una proteína transmembrana que contiene hemo y cobre que contribuye a la tolerancia al estrés del NO en Vibrio cholerae al aliviar el estrés causado por la formación de complejos de hierro-NO61. Cabe destacar que yftE y nnrS forman un solo grupo de genes (BV82_3238 a BV82_3246) con los genes codificantes de NOR y dos reguladores: norR y dnr. La tensión en los grupos de Fe-S causada en P482 por los exudados de tomate se confirma aún más por la regulación positiva de los genes iscR, iscS, iscU, iscA, hscB, hscA y fdx (Fig. 3b) que codifican proteínas relacionadas con la biogénesis de los grupos de azufre62.

Los huéspedes eucarióticos pueden producir óxido nítrico como parte de la defensa durante la infección63. Las plantas utilizan NO como molécula señal en respuesta al estrés biótico y abiótico y a una amplia gama de procesos fisiológicos, incluida la germinación, el desarrollo, la floración y la senescencia64. Dado que el NO es altamente reactivo, se almacena en S-nitrosotioles (SNO), que actúan como reservorios de NO in vivo64. El NO desempeña un papel en la respuesta de las plantas a los patógenos microbianos, pero también es crucial para establecer interacciones simbióticas entre los rizobios y las leguminosas65. Se sugirió que el NO podría ser una molécula de señalización esencial en la comunicación entre plantas y microbios64. En el caso de P482, es importante señalar que la aparente presencia de factores que causan estrés nitrosativo en los exudados de tomate no influyó negativamente en la tasa de crecimiento de P482 in vitro (Fig. S1). Esto implica que P482 está bien adaptado para hacer frente a las condiciones encontradas.

Las pseudomonas poseen una cadena respiratoria ramificada. Se sabe que en P. aeruginosa operan cinco oxidasas terminales diferentes, lo que permite a la bacteria explotar la cadena de transporte de electrones más adecuada en determinadas circunstancias54. En P482, en respuesta a los exudados de tomate pero no al maíz, observamos una regulación negativa de los genes ccoN, ccoO, ccoQ y ccoP que codifican las subunidades de una citocromo c oxidasa de tipo cbb3. Esta oxidasa tiene una alta afinidad por el oxígeno y es vital para la supervivencia celular en condiciones microaeróbicas66. A diferencia de los genes cco, cioA y cioB que codifican la oxidasa insensible al cianuro (CIO) del citocromo bd estaban regulados positivamente. Los microorganismos que pueden cambiar a la vía CIO pueden resistir altas concentraciones de cianuro de hidrógeno, que bloquea la respiración a través de las citocromo c oxidasas67. La cepa P482 es capaz de producir cianuro de hidrógeno68. Sin embargo, en P482 expuesto a exudados de tomate, los genes hcnA y hcnB que codifican la cianuro de hidrógeno sintasa estaban regulados a la baja, lo que implica que la expresión aumentada del citocromo bd insensible al cianuro en esta cepa no ocurre para contrarrestar la toxicidad de los altos niveles de cianuro de hidrógeno de producción propia. .

Aunque los genes cio se asociaron inicialmente con la resistencia bacteriana al cianuro de hidrógeno, otros factores pueden afectar su expresión. El citocromo bd insensible al cianuro desempeña un papel durante la limitación del cobre en condiciones aeróbicas69 y confiere tolerancia bacteriana al estrés oxidativo y nitrosativo70. Además, cioA participó en la evasión de las defensas del huésped por parte de Pseudomonas sp. WCS365 durante la interacción con Arabidopsis thaliana71.

Nuestra hipótesis es que un cambio hacia el citocromo bd (CIO) en P482 tratado con exudados de tomate se debe a la presencia de inhibidores del complejo citocromo bc1 y/o óxido nítrico. Se requiere el complejo de citocromo bc1 para pasar los electrones a las citocromo c oxidasas como cbb3, pero no al CIO, que recibe electrones directamente de la ubiquinona54,72. El efecto bactericida de los inhibidores de bc1 se vio enormemente potenciado por la adición simultánea de donantes de NO en Mycobacterium tuberculosis, un efecto que las bacterias intentaron contrarrestar cambiando a la vía del citocromo bd73. La citocromo bd oxidasa es más resistente a la inhibición del NO debido a la rápida tasa de disociación del NO de su sitio activo.

El metabolismo intermediario en P482 se vio afectado predominantemente por los exudados de tomate. Se enriquecieron tres vías KEGG superpuestas dentro de la respuesta diferenciadora: "metabolismo del piruvato", "metabolismo del propanoato" y "degradación de valina, leucina e isoleucina". Estos comparten genes con COG enriquecidos relacionados con la "producción y conversión de energía" (Fig. 2c, d).

Los exudados de tomate aumentaron la expresión de lpdV, bkdB, bkdA2 y pdhA (Tabla 1). Los productos proteicos de estos genes son los componentes del complejo alfa-ceto deshidrogenasa de cadena ramificada, uno de los tres complejos multienzimáticos que metabolizan el piruvato, el 2-oxoglutarato y los 2-oxoácidos de cadena ramificada. La función general de estos complejos es la conversión de alfa-cetoácidos en acil-CoA y CO2. Los alfa-cetoácidos suelen surgir de la desaminación oxidativa de los aminoácidos y, recíprocamente, son los precursores para su síntesis74. La 2-oxoisovalerato deshidrogenasa codificada por bkdA2 y pdhA es una enzima que participa en la degradación de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA): valina, leucina e isoleucina75. En P482, observamos una regulación positiva simultánea de mmsA y mmsB. En P. aeruginosa, el operón mmsAB está implicado en el metabolismo de la valina, y la alteración de estos genes condujo a un crecimiento prolongado de la cepa en el medio valina/isoleucina76. En algunas bacterias, la disponibilidad de BCAA parece tener funciones reguladoras y desempeña un papel en procesos como la proliferación durante la infección y la evasión de las defensas del huésped78. En contraste con lo que observamos para P482 en presencia de exudados de tomate, tanto S. typhimurium como E. fredii aumentaron la síntesis de BCAA, y no su catabolismo, cuando se expusieron a los exudados de lechuga y maíz intercalado, respectivamente79,80.

Además de los BCAA, el catabolismo de otros tres aminoácidos parece inducirse en P482 tras el tratamiento con exudado de tomate. Esto incluyó fenilalanina (genes phhA, phhB y phhC), glicina (gcvH y gcvP) y metionina (aceE/mdeB, mdeA) (Tabla 1).

Otros cambios metabólicos en P482 asociados con un mayor catabolismo de aminoácidos y/o ácidos grasos incluyen la regulación positiva de las acil-CoA deshidrogenasas MmgC e Ivd, que catalizan la α,β-deshidrogenación de los ésteres de acil-CoA81, y la regulación positiva de la aceA que codifica la isocitrato liasa. este último implica la activación de la derivación de glioxilato (GS). Muchas bacterias activan GS cuando el acetil-CoA, derivado del catabolismo de aminoácidos o ácidos grasos, es la principal fuente de carbono y energía disponible para la célula82. El ciclo clásico del ácido tricarboxílico (TCA) no puede asimilar carbono y reciclar citrato cuando el acetil-CoA es la única fuente de carbono disponible debido a la pérdida de CO2 y la incapacidad de reciclar oxalacetato. El GS evita los pasos del TCA que producen dióxido de carbono y desvía parte del flujo de carbono en el isocitrato. Aparte de su papel esencial en el metabolismo de acetatos y ácidos grasos, la derivación de glioxilato puede desempeñar un papel aún poco explorado en la defensa y la patogénesis del estrés. La expresión de aceA en P. aeruginosa se reguló positivamente bajo estrés oxidativo inducido por H2O2 y bajo condiciones limitantes de hierro y está relacionada con la homeostasis intercelular del hierro72. Esta vía metabólica también es fundamental para el crecimiento y la virulencia de P. aeruginosa durante la infección, cuando la bacteria muestra preferencia por el catabolismo de los ácidos grasos83. Además, se demostró que la derivación del TCA y el cambio hacia la utilización de aminoácidos aumentan la resistencia a los antibióticos en P. aeruginosa84. Curiosamente, el GS se activó en el patógeno humano Salmonella cuando se cultivó con exudados de lechuga79.

Aquí, analizamos el contenido de exudado inicial (descripción detallada en SI). El análisis LC-SRM del contenido relativo de aminoácidos en los exudados de maíz y tomate mostró que los BCAA valina y leucina eran aproximadamente 4 veces más abundantes en los exudados de maíz que en los de tomate, el contenido de isoleucina fue igual en ambas muestras (Tabla S7). . La cantidad de fenilalanina y triptófano fue 4,5 y 2,3 veces mayor en el maíz que en el tomate, respectivamente. La abundancia de metionina en los dos exudados no fue diferente. Por lo tanto, no es cierto que los aminoácidos, cuyo catabolismo está regulado positivamente en P482 tratado con exudados de tomate, sean más abundantes en este tratamiento. En nuestra configuración experimental, la influencia de la suplementación con exudado sobre P482 se evaluó en un medio mínimo que contenía glucosa. Esto convirtió a la glucosa en la fuente de carbono más abundante en los tratamientos y el control. Se aplicó un enfoque similar en el estudio sobre la influencia de los exudados de B. distachyon en diferentes Pseudomonas spp.31. Es posible que P482, en cultivos con exudados de tomate, agotara la glucosa más rápidamente que en las muestras suplementadas con maíz. Por lo tanto, en el momento de la cosecha, las células tratadas con tomate ya utilizarían aminoácidos para favorecer su crecimiento. El análisis no dirigido utilizando 1H-NMR reveló que la glucosa, si bien era muy abundante en los exudados de maíz (9947 ng mg-1), no estaba presente en los exudados de tomate (Tabla S8, Figs. S6, S7). Sin embargo, sigue siendo cuestionable si la cantidad de glucosa añadida con los exudados sería suficiente para tener tal impacto en la disponibilidad total de glucosa en medio 1C.

Proponemos que un cambio al catabolismo de aminoácidos en P482 tratado con tomate tiene como objetivo aumentar la resistencia de las células a los factores estresantes de manera similar a lo que se informó para P. aeruginosa en modelos de infección humana83,84. La presencia de NO, que daña los grupos Fe-S en los centros activos de algunas enzimas, puede comprometer determinadas vías metabólicas. En tal caso, el cambio observado en el metabolismo intermediario de P482 no estaría impulsado por una preferencia por fuentes de carbono específicas y su disponibilidad en los exudados, sino más bien por la elección de vías metabólicas menos sensibles al factor estresante particular. Los factores estresantes derivados de las plantas podrían ser específicos de cada especie o estar relacionados con el estado fisiológico de una planta determinada. La exactitud de esta hipótesis requiere más estudios.

En presencia de exudados de tomate, la expresión de los genes que codifican la triptófano sintasa, trpA y trpB, se reguló significativamente a la baja, lo que implica una síntesis reducida de triptófano por parte de P482. El triptófano es un aminoácido aromático proteinogénico que también puede ser un precursor de moléculas de señalización como la hormona vegetal ácido indol-3-acético (IAA), la quinurenina y la señal de quinolona de Pseudomonas (PQS)85. Por el contrario, observamos una regulación positiva significativa de metE (4,73 log2FC). MetE es un 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato, una homocisteína S-metiltransferasa que cataliza la transferencia de un grupo metilo del 5-metiltetrahidrofolato a la homocisteína, lo que da como resultado la formación de metionina. Los genes relacionados con la síntesis de metionina aumentaron en E. coli después del tratamiento con S-nitrosoglutatión en condiciones que imitaban el estrés nitrosativo. En el último estudio, los mutantes de E. coli alterados en la vía de síntesis de metionina mostraron una menor tolerancia al S-nitrosoglutatión y la adición de metionina exógena podría anular este efecto86. Esto sugiere que la metionina también podría desempeñar un papel en contrarrestar el estrés nitrosativo en P482.

Además, la síntesis de metionina fue esencial para establecer la simbiosis entre Sinorhizobium meliloti, fijador de nitrógeno, y su planta huésped, Medicago sativa87. Al contrario de lo que observamos en P482 en presencia de exudados de raíz de tomate, la síntesis de metionina disminuyó en PAO1 en respuesta a exudados de remolacha25 y en S. typhimurium en respuesta a exudados de lechuga79. Esto sugiere que el papel de la síntesis de metionina en las bacterias asociadas a las plantas depende del sistema planta-microbio estudiado.

En el contexto de cómo se ven afectados la síntesis de aminoácidos y el catabolismo en el P482 tratado con tomate, vale la pena mencionar que estos también pueden tener causas menos directas. En P. fluorescens, la fenilalanina 4-hidroxilasa (PAH) participa no solo en el catabolismo de la fenilalanina sino también en la biosíntesis de melatonina antioxidante a partir de triptófano88,89. También se demostró que el triptófano, la metionina, la tirosina y la fenilalanina, los conocidos precursores de los metabolitos secundarios de las plantas, pueden contribuir a una mayor resistencia de las plantas90. Se puede especular que el P482, al degradar la fenilalanina, reducir la síntesis de triptófano y equilibrar los niveles de metionina, puede intentar contrarrestar e influir en lo que "interpreta" como la respuesta inmune de la planta.

Los exudados de maíz provocaron la regulación positiva de tres subunidades de la proteína de fusión de membrana (MFP) de los exportadores de RND: mexE, BV82_1337 y BV82_1618. La expresión de mexE fue particularmente regulada positivamente (4,12 log2FC). RND significa superfamilia de bombas de eflujo de resistencia-nodulación-división. Las bombas de expulsión de la superfamilia RND y las proteínas Omp forman complejos proteicos que permiten a las bacterias gramnegativas exportar fármacos nocivos directamente fuera de la célula y no, como en el caso de otros sistemas de expulsión, al espacio periplasmático. Esto hace que las bombas de eflujo RND sean determinantes importantes de la resistencia a múltiples fármacos91. En P. aeruginosa, varios operones de eflujo confieren resistencia intrínseca de la bacteria a los antibióticos, y el operón mexEF-oprN que contiene mexE confiere resistencia a las quinolonas, cloranfenicol y trimetoprim92. Sin embargo, es probable que la resistencia a los antibióticos sintéticos sea sólo un efecto secundario de la resistencia a los metabolitos secundarios naturales. Se demostró que la expresión de smeDEF es desencadenada por flavonoides producidos por plantas, y que la inactivación de la bomba mediante la eliminación de smeE afectó la capacidad de Stenotrophomona maltophilia para colonizar las raíces de la planta de colza93. Por lo tanto, es plausible que la sobreexpresión de mexE en P482 en respuesta a los exudados de maíz participe en contrarrestar la presencia de metabolitos secundarios particulares específicos de esta planta huésped. En consonancia con el efecto específico del huésped está el hecho de que sólo determinados transportadores de RND, y no todos, fueron inducidos en presencia de maíz. La regulación positiva de czcA y mdtA, que también codifican bombas de eflujo RND, fue impulsada por el tomate (Tabla 1). Se sabe que el maíz y otras gramíneas (Poaceae) producen y secretan benzoxazinoides biocidas, compuestos con un papel establecido en la configuración del microbioma de la planta27,94. Parece que vale la pena investigar si los transportadores RND desempeñan un papel en la tolerancia de algunas bacterias a los benzoxazinoides.

Ambos exudados aumentaron la expresión de copA y copZ en P482. Sin embargo, la inducción de esos genes fue mucho mayor en respuesta al maíz (Tabla 1). CopA es una ATPasa transmembrana responsable del flujo de salida de iones Cu+ entregados por la chaperona citoplasmática CopZ. Ambas proteínas son elementos de sistemas de tolerancia al Cu+ bien caracterizados95. El cobre es un oligoelemento esencial para todos los organismos; sin embargo, es tóxico en exceso96. El cobre en forma de CuSO4 es un ingrediente del medio de crecimiento vegetal de Hoagland, utilizado en este estudio para cultivar tomate y maíz. Por lo tanto, el hecho de que la respuesta de tolerancia al cobre sea mucho más sólida en los exudados de maíz que en los de tomate debe deberse a factores dependientes del huésped que afectan la disponibilidad o la toxicidad del cobre. Mavrodi y colaboradores31 mostraron una considerable regulación positiva de uno o más genes cop relacionados con la tolerancia al cobre en 5 de 8 pseudomonas investigadas tratadas con exudados de B. distachyon. Tanto el maíz como B. distachyon son pastos monocotiledóneas y ambos fueron cultivados en Hoagland's para los respectivos experimentos.

En P482, los exudados de maíz provocaron una regulación positiva de BV82_2809 que codifica FimV, una proteína implicada en el ensamblaje de los pili tipo IV. Los pili tipo IV están involucrados en la adherencia, ciertos tipos de movimiento (un deslizamiento social en Myxococcus xanthus y espasmos en las especies de Pseudomonas y Neisseria) y la formación de biopelículas, la invasión tisular guiada y otros eventos relacionados con la patogénesis97. Los pili tipo IV son esenciales para la colonización endófita del arroz por parte del endófito fijador de N2 Azoarcus sp. cepa BH7298. Curiosamente, pilK, implicado en la motilidad de las contracciones, fue regulado negativamente en P. aeruginosa en respuesta a los exudados de remolacha25, lo que sugiere que los exudados de remolacha tienen un efecto de disminución de la formación de pili en P. aeruginosa, a diferencia del efecto estimulante de los compuestos del maíz en P. donghuensis.

Los exudados de maíz provocaron un aumento de la expresión de fliS en P482, lo que sugiere una mayor síntesis de flagelos relacionados con la natación. Los flagelos son esenciales para que algunas cepas de Pseudomonas colonicen a sus huéspedes de manera eficiente. P. fluorescens F113 con un gen fliS alterado no era móvil y no podía competir con la cepa de tipo salvaje (WT) para colonizar la punta de la raíz de alfalfa99.

A diferencia de las células tratadas con maíz, no se observó una regulación positiva de genes relacionados con la síntesis de pili y flagelos en P482 tratado con exudados de tomate. Todo lo contrario, los exudados de tomate regulaban positivamente la expresión de un presunto regulador negativo del operón maestro flagelar flhDC en el locus BV82_3459. Se demostró que, si bien los flagelos pueden aportar ventajas a las células, su síntesis también puede conllevar algunas desventajas. El reconocimiento de antígenos flagelares específicos puede inducir una respuesta hipersensible y muerte celular como parte de la respuesta inmune del huésped100. Una disminución en la síntesis de flagelos se considera un mecanismo importante para evadir la inmunidad de las plantas101. Los estudios sobre P. putida KT2440 sobre las compensaciones metabólicas de la producción de flagelos mostraron que una cepa mutante no flagelada presenta una fase de retraso más corta y es más resistente al estrés oxidativo que la cepa WT. Se sugirió que la falta de gasto metabólico en la producción de flagelos podría proporcionar a las células un excedente de energía (ATP) y reducir la energía (NADPH) que las células pueden asignar a otras actividades, incluida la resistencia al estrés102. Por lo tanto, parece que las ventajas de tener una menor expresión de genes flagelares superan las posibles desventajas de aptitud física en P482 tratado con exudados de tomate. Los exudados de tomate también regularon a la baja dos genes que codifican proteínas del dominio de señalización de quimiotaxis (MCP) que aceptan metilo, que funcionan como quimiorreceptores predominantes en bacterias y arqueas103.

En conjunto, los exudados de maíz aumentaron la expresión de funciones relacionadas con la motilidad en P482, mientras que se observó lo contrario en respuesta a los exudados de tomate. Queda por dilucidar si esas diferencias están relacionadas con la importancia variable de la motilidad en la colonización de estos dos huéspedes, o más bien fue el estado fisiológico del tomate muestreado en busca de exudados en nuestro estudio lo que hizo que la expresión de esos genes fuera desfavorable.

Comprender las interacciones entre plantas y microbios es un requisito clave para aprovechar el potencial de los microbios para respaldar la salud de las plantas. Estudiar esas interacciones en toda la complejidad de los sistemas naturales sigue siendo un desafío técnico. Por lo tanto, las configuraciones simplificadas que aíslan las interacciones seleccionadas continúan ayudando a obtener información valiosa31,104. Aquí, identificamos qué aspectos del metabolismo de P. donghuensis P482 se ven afectados de manera diferente por los exudados de raíces de dos plantas hospedantes diferentes: tomate y maíz (Fig. 4). La composición de los exudados analizados y, por tanto, su influencia sobre P482, son muy probablemente el resultado tanto del genotipo de las plantas muestreadas como de su estado fisiológico. Concluimos que el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada cambia a la derivación de glioxilato, la resistencia al óxido nítrico, el uso flexible de la cadena respiratoria, la síntesis de metionina y la activación selectiva de las bombas de eflujo de tipo RND merecen especial atención en términos de su papel en la forma promiscua de la raíz. Las Pseudomonas colonizadoras se adaptan a diferentes plantas hospedantes y cómo permanecen asociadas cuando se las desafía a un cambio en el estado fisiológico del hospedador.

Respuestas transcriptómicas compartidas y específicas del huésped de P. donghuensis P482 a los exudados de tomate y maíz. Las flechas rojas que apuntan hacia arriba indican la regulación positiva de una vía, mientras que las flechas azules que apuntan hacia abajo indican la regulación negativa.

Se dedica mucha atención al ensamblaje del microbioma a la atracción entre los microbios y la planta. En contradicción con esta tendencia, la mayoría de las vías específicas del huésped que hemos descrito en P482 están relacionadas con la resistencia al estrés. A pesar de eso, los exudados estimularon y no inhibieron el crecimiento de P482. Una mayor resiliencia de algunos microbios a factores estresantes particulares puede provocar cambios en las poblaciones microbianas asociadas a las plantas, particularmente en plantas con respuestas activadas al estrés. Paralelamente al comportamiento social humano, no preocuparse por los arrebatos de la pareja puede ser un factor subestimado a la hora de decidir quedarse.

Las lecturas de secuenciación sin procesar para este estudio están disponibles en la base de datos de lectura de secuenciación del NCBI (PRJNA868728). Los archivos de análisis de genes diferenciales se depositaron en NCBI Gene Expression Omnibus (GSE211040).

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Descargar referencias

Nos gustaría agradecer al Prof. Steven E. Lindow (Universidad de California-Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.) por su valiosa contribución a la mejora del manuscrito y su útil discusión, al Prof. Asociado R. Czajkowski (IFB UG & MUG, Gdansk, Polonia) por sus útiles comentarios sobre la versión casi final, y a Tomasz Krzyżanowski (especialista en TI, Varsovia, Polonia) por escribir un script para extraer datos de archivos GenBank. También apreciamos mucho los aportes de los revisores anónimos.

Esta investigación fue financiada por el Centro Nacional de Ciencias (Polonia), proyecto No. 2017/25/B/NZ9/00513 para S. Jafra.

Laboratorio de Microbiología Vegetal, Facultad Intercolegial de Biotecnología UG y MUG, Universidad de Gdańsk, ul. A. Abrahama 58, 80-307, Gdansk, Polonia

Dorota M. Krzyżanowska, Magdalena Jabłońska y Sylwia Jafra

Laboratorio de Bioquímica Estructural, Facultad de Química, Universidad de Gdańsk, ul. Wita Stwosza 63, 80-308, Gdansk, Polonia

Zbigniew Kaczyński y Małgorzata Czerwicka-Pach

Laboratorio de Espectrometría de Masas, Facultad Intercolegial de Biotecnología UG y MUG, Universidad de Gdańsk, ul. A. Abrahama 58, 80-307, Gdansk, Polonia

Katarzyna Macur

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DMK coordinó el trabajo experimental, participó en la recolección de exudados y cultivos de plantas, procesó los exudados para análisis, llevó a cabo cultivos bacterianos, aislamiento de ARN, RT-qPCR, experimento de colonización de raíces, enriquecimiento funcional y análisis de redes de los datos de RNAseq, preparó todas las figuras y tablas, y redacté el manuscrito. MJ cultivó plantas en condiciones gnotobióticas y ayudó con la recolección de exudados. ZK realizó mediciones de RMN. MCP realizó GC-MS. KM realizó el análisis del contenido de aminoácidos por LC-SRM. SJ concibió el estudio, adquirió financiación, supervisó y coordinó el proyecto y revisó el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Sylwia Jafra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Krzyżanowska, DM, Jabłońska, M., Kaczyński, Z. et al. Rasgos adaptativos del huésped en Pseudomonas donghuensis P482 colonizadora de plantas revelados por respuestas transcriptómicas a exudados de tomate y maíz. Representante científico 13, 9445 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36494-6

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Recibido: 24 de enero de 2023

Aceptado: 05 de junio de 2023

Publicado: 09 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36494-6

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